NGS系列產(chǎn)品之表觀(guān)遺傳----ATAC和Cut&Tag

解鎖DNA-蛋白互作研究新技術(shù)，快來(lái)圍攻表觀(guān)遺傳的新秀

染色質(zhì)可及性

真核生物的核DNA并不是裸露的，而是有蛋白質(zhì)即組蛋白與之相結合。DNA一圈一圈地纏繞在組蛋白上，形成串珠式的結構。這樣的結構還能夠進(jìn)一步折疊、濃聚，并在其他架構蛋白的輔助下，形成染色體。DNA的復制，基因的轉錄，需要將DNA的高級結構解開(kāi)。不需要將整個(gè)染色體全部打開(kāi)，只需打開(kāi)表達基因的區域。這一過(guò)程，主要由染色體的表觀(guān)修飾來(lái)實(shí)現。而這部分打開(kāi)的染色質(zhì)，就叫開(kāi)放染色質(zhì)（open chromatin）。染色質(zhì)一旦打開(kāi)，就允許調控蛋白（比如轉錄因子和輔因子）與之相結合。染色質(zhì)的這種特性，就叫做染色質(zhì)的可進(jìn)入性或可及性（chromatin accessibility），如圖1所示。

DNA折疊與開(kāi)放示意圖

表觀(guān)遺傳學(xué)&研究方法

表觀(guān)遺傳學(xué)是一門(mén)研究基因表達調控的科學(xué)，它關(guān)注的是如何在不改變DNA序列的情況下，使基因表達受到行為、環(huán)境和表型的影響，可以說(shuō)染色質(zhì)的可及性對于基因表達的影響非常關(guān)鍵。表觀(guān)遺傳學(xué)的研究背景主要是基于對基因表達調控的深入理解，以及探索環(huán)境因素如何影響基因的活性和表達。

表觀(guān)遺傳學(xué)的研究方法包括但不限于以下幾種：

1. ATAC-seq技術(shù)：這是一種用于分析染色質(zhì)可及性的方法，可以揭示基因組中開(kāi)放區域，這些區域通常是轉錄因子結合的位點(diǎn)。

2. 全基因組亞硫酸氫鹽測序(WGBS)：這種方法可以檢測全基因組水平上的DNA甲基化狀態(tài)，是研究表觀(guān)遺傳學(xué)中DNA甲基化的重要手段。

3. 簡(jiǎn)化代表性亞硫酸氫鹽測序(RRBS)：這是一種針對基因組中富含CpG島區域的DNA甲基化分析方法，相對于WGBS，它成本較低。

4. 甲基化DNA免疫共沉淀測序(MeDIP-seq)：通過(guò)使用抗甲基化DNA的抗體富集甲基化DNA片段，然后進(jìn)行測序，以研究甲基化模式2。

5. 染色質(zhì)免疫共沉淀測序(ChIP-seq)：通過(guò)使用特定抗體富集與組蛋白修飾或轉錄因子結合的DNA片段，然后進(jìn)行測序，用于研究蛋白質(zhì)-DNA相互作用。

6. CUT&Tag技術(shù)：這是一種較新的技術(shù)，用于在單細胞水平上研究蛋白質(zhì)-DNA相互作用，相較于ChIP-seq，它更為簡(jiǎn)便且適用于少量細胞樣本2。

7. 3C-seq技術(shù)：這是一種用于研究染色質(zhì)三維結構的技術(shù)，可以揭示基因組中不同區域的空間相互作用。

8. RNA測序(RNA-seq)：通過(guò)測序RNA分子來(lái)研究基因表達水平，是研究非編碼RNA和基因表達調控的重要方法。

這些方法的應用和普及改變了人們對多種表觀(guān)遺傳現象的傳統認識，使研究人員能夠更加全面地深入了解各種表觀(guān)遺傳標志在機體內的廣泛分布，以及它們如何在外界因素的影響下發(fā)生相應的動(dòng)態(tài)變化。其中ATAC和Cut&Tag由于其靈敏度高，操作方便等優(yōu)點(diǎn)，成為研究表觀(guān)遺傳學(xué)的利器。下面我們就這兩種方法來(lái)進(jìn)行詳細的介紹。

ATAC-seq技術(shù)詳解

ATAC-seq

ATAC（Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing）是一種用于研究染色質(zhì)可及性的高通量測序技術(shù)。它的原理是：染色質(zhì)的開(kāi)放區域更容易被轉錄因子和其他調控蛋白訪(fǎng)問(wèn)，這些區域通常與基因的活躍表達相關(guān)。該方法通過(guò)Tn5轉座酶將序列接頭插入到染色質(zhì)開(kāi)放區域，然后通過(guò)DNA測序數據分析來(lái)推斷染色質(zhì)各區域的基因活躍度情況。

ATAC-seq的關(guān)鍵步驟：

1. 樣本準備：首先從細胞中提取染色質(zhì)，這是DNA和組蛋白緊密結合形成的物質(zhì)，它決定了基因的可訪(fǎng)問(wèn)性。

2. 染色質(zhì)裂解：通過(guò)裂解細胞，釋放出染色質(zhì)，使其暴露出更多的表面區域。

3. 轉座酶處理：使用一種特殊的轉座酶Tn5，這種酶能夠識別開(kāi)放的染色質(zhì)區域，并在這些區域切割DNA。

4. DNA片段化：轉座酶在開(kāi)放染色質(zhì)區域切割DNA，產(chǎn)生小片段。

5. 測序接頭插入：轉座酶不僅切割DNA，還會(huì )在其切割位點(diǎn)插入測序所需的接頭序列。

6. 高通量測序：對這些切割并帶有接頭的DNA片段進(jìn)行高通量測序，以識別開(kāi)放染色質(zhì)區域。

7. 數據分析：測序數據通過(guò)生物信息學(xué)分析，確定開(kāi)放染色質(zhì)區域的位置，這些區域可能包含調控基因表達的關(guān)鍵元件。

ATAC實(shí)驗原理示意圖

CUT&Tag技術(shù)詳解

CUT&Tag

CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）是一種用于研究蛋白質(zhì)-DNA相互作用的技術(shù)，該技術(shù)利用Tn5轉座酶的特點(diǎn)，在切割染色質(zhì)的同時(shí)直接插入接頭（adaptor），極大地縮減了建庫時(shí)間，且對樣本量的要求更低，所需的測序深度也更低。

CUT&Tag的關(guān)鍵步驟：

1. 樣本準備：選擇或分離單細胞樣本，這對于研究細胞異質(zhì)性非常重要。

2. 抗體介導的富集：使用特定抗體識別并結合目標蛋白，這些蛋白可能是轉錄因子、組蛋白修飾或其他染色質(zhì)結合蛋白。

3. Tn5酶切割：Protein A-Tn5酶復合體被引導至目標蛋白結合的DNA區域，并在這些區域切割DNA。

4. 測序接頭添加：在切割位點(diǎn)添加測序所需的接頭序列。

5. PCR擴增：由于單細胞樣本中DNA量較少，需要通過(guò)PCR擴增來(lái)增加DNA片段的數量，以便進(jìn)行高通量測序。

6. 高通量測序：對擴增后的DNA片段進(jìn)行高通量測序，識別目標蛋白結合的DNA區域。

7. 數據分析：測序數據通過(guò)生物信息學(xué)分析，確定目標蛋白在基因組中的結合位點(diǎn)，這些位點(diǎn)可能與基因調控密切相關(guān)。

Cut&Tag實(shí)驗原理示意圖

ATAC PK CUT&Tag

ATAC-seq和CUT&Tag是兩種用于研究染色質(zhì)狀態(tài)和蛋白質(zhì)-DNA相互作用的表觀(guān)遺傳學(xué)技術(shù)。它們在某些方面有相似之處，但也有明顯的區別。以下是對這兩種技術(shù)的詳細比較：

ATAC-seq與CUT&Tag的聯(lián)系：

1. 轉座酶Tn5的使用：ATAC-seq和CUT&Tag都利用了轉座酶Tn5的特性來(lái)切割染色質(zhì)。這種酶能夠識別開(kāi)放的染色質(zhì)區域，并在這些區域切割DNA。

2. 染色質(zhì)開(kāi)放性的分析：兩種技術(shù)都可以用于分析染色質(zhì)的開(kāi)放性，即哪些區域是轉錄因子和其他調控蛋白可以訪(fǎng)問(wèn)的。

3. 高通量測序：ATAC-seq和CUT&Tag最終都涉及到對特定DNA片段進(jìn)行高通量測序，以獲得基因組范圍內的信息。

4. 表觀(guān)遺傳學(xué)研究：它們都是表觀(guān)遺傳學(xué)研究的重要工具，有助于理解基因表達調控的機制。

ATAC-seq與CUT&Tag的區別：

結合使用這兩種技術(shù)可以提供更全面的表觀(guān)遺傳學(xué)信息。ATAC-seq提供了染色質(zhì)開(kāi)放性的全局視圖，而CUT&Tag則提供了特定蛋白質(zhì)結合位點(diǎn)的詳細信息。這種聯(lián)合方法使研究人員能夠同時(shí)研究染色質(zhì)的可及性和特定蛋白質(zhì)的結合模式，從而更深入地理解基因表達調控的復雜性。通過(guò)理解ATAC-seq和CUT&Tag的區別與聯(lián)系，研究人員可以根據具體的研究目的和樣本條件選擇合適的方法，或者將兩種技術(shù)聯(lián)合使用，以獲得更豐富的生物學(xué)信息。

經(jīng)過(guò)以上介紹，相信大家已經(jīng)對ATAC和Cut&Tag的研究方法以及它們之間的區別和聯(lián)系有了一定的了解，目前這2種技術(shù)也被廣泛的應用于表觀(guān)遺傳學(xué)的研究。全式金生物作為國產(chǎn)生物試劑原料供應商，深耕分子生物學(xué)領(lǐng)域多年，始終堅持自主創(chuàng )新，為客戶(hù)提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和服務(wù)。我們提供的ATAC、CUT&Tag建庫試劑盒，建庫效率高，測序數據質(zhì)量好，助力表觀(guān)遺傳學(xué)研究。

ATAC-Seq

TransNGS^? ATAC-Seq Library Prep Kit for Illumina^?

ATAC文庫構建試劑盒（KP171）

產(chǎn)品特點(diǎn)

? 細胞數量少：所需細胞量少，50-50000細胞的起始量均可以獲得高分辨率的測序圖譜。

? 建庫時(shí)間短：5000及以下細胞時(shí)，建庫時(shí)間可縮短至2 h以?xún)取?/span>

? 文庫產(chǎn)量高：文庫質(zhì)量高，峰型好。

? 文庫峰型好：文庫峰型200-2000 bp，無(wú)明顯接頭峰。

? 無(wú)需分選：如對文庫長(cháng)度分布無(wú)特殊要求，可以不用分選。

產(chǎn)品數據

產(chǎn)量高，峰型好

對不同細胞投入量（50-1,000 cells）的HeLa 細胞進(jìn)行ATAC 文庫構建，不同細胞投入量的擴增循環(huán)數如下表。結果表明，TransGen 產(chǎn)品可用于構建低起始量（50 個(gè)細胞）的ATAC 文庫，文庫產(chǎn)量高，峰型好。

? 文庫產(chǎn)量

?  文庫峰型

? 與競品比較

分別使用TransGen 和Company V 產(chǎn)品對不同細胞投入量（5,000-50,000 cells）的HeLa 細胞進(jìn)行ATAC 文庫構建。結果表明，TransGen 產(chǎn)品的文庫產(chǎn)量、文庫峰型優(yōu)于競品。

? 文庫產(chǎn)量

?  文庫峰型

?  下機數據好

對不同細胞投入量（50-50,000 cells）的HeLa 細胞進(jìn)行ATAC 文庫構建，將構建后的文庫測序，下機后進(jìn)行生信分析。結果表明，IGV 視圖顯示ATAC 在關(guān)鍵位點(diǎn)與H3K4me3 基因的ChIP-seq 結果一致，實(shí)驗結果真實(shí)可靠。

CUT&Tag

TransNGS^? CUT&Tag Library Prep Kit for Illumina^?

CUT&Tag 建庫試劑盒（KP172）

產(chǎn)品特點(diǎn)

? 文庫產(chǎn)量高，峰型好

? 細胞投入范圍廣：適用于10-105 個(gè)哺乳動(dòng)物細胞或經(jīng)過(guò)處理的細胞核，以及無(wú)細胞壁結構的真核細胞（如植物細胞原生質(zhì)體等）建庫

? 操作時(shí)間短：約5.5 小時(shí)即可完成文庫構建

? 測序質(zhì)量好：相同抗體孵育下，文庫的mapping 率更高，duplicates 率更低（尤其是在細胞投入量較少的時(shí)候）

? peak 位點(diǎn)準確有效：與ATAC-seq 的peak 相比，陽(yáng)性對照的peak 位點(diǎn)均真實(shí)有效

產(chǎn)品數據

不同細胞起始量建庫結果

使用TransGen 產(chǎn)品，分別對不同起始量的293T 細胞進(jìn)行CTCF 抗體的CUT&Tag 實(shí)驗，結果表明，TransGen 產(chǎn)品文庫產(chǎn)量高，不同細胞投入量下的文庫峰型和peak 位點(diǎn)基本保持一致，兼容低細胞投入量（10 cells）的文庫構建。

? 文庫產(chǎn)量

? 文庫峰型

? Peak位點(diǎn)準確有效

不同細胞核建庫結果

使用TransGen 產(chǎn)品，分別對293T 細胞核、擬南芥核進(jìn)行不同抗體的CUT&Tag 實(shí)驗，結果表明，TransGen 產(chǎn)品建庫產(chǎn)量高，文庫峰型標準，適用于動(dòng)物和植物細胞核的建庫。

? 文庫產(chǎn)量

? 文庫峰型

? 與競品比較

使用TransGen 和Company V 產(chǎn)品對不同起始量的293T 細胞進(jìn)行H3k4me3 抗體、CTCF 抗體和RNAPol II 抗體的CUT&Tag 實(shí)驗，比較文庫產(chǎn)量，文庫峰型和測序結果。與Company V 相比，TransGen 產(chǎn)品文庫產(chǎn)量更高，文庫峰型更標準，測序數據質(zhì)量高，兩者的peak 位點(diǎn)基本一致。

? 文庫產(chǎn)量

? 文庫峰型

? 測序數據

? Peak位點(diǎn)準確有效

使用TransGen 產(chǎn)品，針對1×10⁴ 個(gè) 293T 細胞的不同靶蛋白（CTCF、H3k4me3、 RNAPol II）得到的CUT&Tag 文庫與293T 細胞的ATAC 文庫進(jìn)行peak 位點(diǎn)的比對，結果表明，各種CUT&Tag 文庫的peak 位置準確。

使用TransGen 和Company V 產(chǎn)品，針對5×104 個(gè)293T 細胞的不同靶蛋白（CTCF、H3k4me3、 RNAPol II）得到的CUT&Tag 文庫，在2個(gè)不同染色體區段進(jìn)行peak位點(diǎn)展示，結果表明，TransGen 和Company V 的peak 位點(diǎn)基本一致。

不同靶蛋白的DNA 互作區域peak 對比圖

全式金生物提供的ATAC-Seq、CUT&Tag建庫試劑盒，高效&精準&簡(jiǎn)便，助您輕松玩轉表觀(guān)遺傳學(xué)研究。

產(chǎn)品信息

參考文獻：

DNA Packaging: Nucleosomes and Chromatin